WERSJA POLSKA

ZESZYT 348

Brygida Ślaska
Genomika strukturalna jenota (Nyctereutes procyonoides procyonoides)

Jenot (Nyctereutes procyonoides procyonoides) jest jednym z gatunków zwierząt futerkowych hodowanych głównie w celu pozyskania skór. Obecnie informacje o genomie jenota są nieliczne. 
Cel pracy. Badania przedstawione w rozprawie zmierzały do poszerzenia wiedzy na temat genomu jenota w zakresie genomiki strukturalnej w aspekcie poznawczym oraz aplikacyjnym poprzez: ustalenie poziomu konserwatyzmu genetycznego pomiędzy psem i jenotem; ocenę bioróżnorodności jenotów hodowanych w krajowych fermach zwierząt futerkowych i jenotów dziko żyjących; opracowanie wiarygodnego systemu kontroli pochodzenia, a w tym weryfikację tezy o występowaniu w jednym miocie półrodzeństwa pochodzącego z krycia przez więcej niż jednego samca; ustalenie konsekwencji i rozwiązań dla zjawiska promiskuityzmu jenotów; budowę mapy genetycznej jenota i mapowanie genomu w celu identyfikacji QTL.
Materiał i metody. Badaniami objęto jenoty hodowane w trzech fermach różnych rejonów Polski w latach 2005–2009 oraz jenoty dziko żyjące. Łącznie uwzględniono 376 osobników. Zmienność genetyczną na poziomie molekularnym analizowano z wykorzystaniem 20 sekwencji mikrosatelitarnych. Startery do amplifikacji pochodziły z danych literaturowych opracowanych dla genomu psa domowego, należącego podobnie jak jenot do rodziny Canidae. Analizowane sekwencje mikrosatelitarne poddano sekwencjonowaniu. Przeprowadzono analizę porównawczą in silico sekwencji mikrosatelitarnych jenota i psa. Badania obejmowały też charakterystykę struktury genetycznej i analizę filogenetyczną trzech grup jenotów hodowlanych i dziko żyjących. Przeprowadzono również analizę pochodzenia, wykorzystując dane dotyczące markerów kodominujących w celu opracowania wiarygodnego systemu kontroli pochodzenia, a w tym weryfikację tezy o występowaniu w jednym miocie półrodzeństwa, pochodzącego z krycia przez więcej niż jednego samca oraz ustalenia konsekwencji i rozwiązań dla zjawiska promiskuityzmu jenotów. Przeprowadzono analizę sprzężeń pomiędzy polimorficznymi loci. Wykorzystano dane rodowodowe i fenotypowe zwierząt pochodzące z dokumentacji hodowlanej, jak również ich genotypy w polimorficznych loci mikrosatelitarnych, w celu znalezienia związku pomiędzy genotypami a cechami użytkowymi i funkcjonalnymi jenotów. Materiał do identyfikacji QTL stanowiła rodzina referencyjna – trzypokoleniowa populacja licząca 290 osobników. Do przeprowadzenia testów poszukiwania QTL stosowano dwa jednocechowe, mieszane modele osobnicze. Korelacje genetyczne oszacowano na podstawie wyników analiz modelu wielocechowego. Ustalono również estymatory wpływów epistatycznych. 
Wyniki i dyskusja. Wykorzystując informacje na temat sekwencji genomu psa, uzyskano produkty amplifikacji wszystkich objętych analizami markerów mikrosatelitarnych jenota. W wyniku przeprowadzonej reakcji sekwencjonowania objętych analizami loci mikrosatelitarnych stwierdzono, iż w przypadku 80% markerów motywy powtarzalne miały identyczną organizację w genomie jenota i psa. W przypadku 10% loci odnotowano wysoki stopień podobieństwa motywów powtarzalnych. W analizowanych 20 loci mikrosatelitarnych zidentyfikowano łącznie 130 alleli. Średnia liczba alleli we wszystkich loci różnych grup jenotów wahała się od 4,45 do 6,15. W poszczególnych grupach jenotów odnotowano obecność alleli konserwatywnych i specyficznych. 80% analizowanych markerów charakteryzowało się wysokim indeksem stopnia polimorfizmu. Dystans genetyczny pomiędzy czterema grupami jenotów przyjmował niskie wartości i wahał się od 0,083 do 0,143. Najwyższą jego wartość odnotowano pomiędzy jenotami z populacji A i dziko żyjącymi. Wykorzystując tylko trzy locimikrosatelitarne o najwyższym indeksie stopnia polimorfizmu, łączne prawdopodobieństwo wykluczenia wynosiło 0,95, a przy użyciu 11 najbardziej informatywnych markerów – przekroczyło wartość 0,9999. Prawdopodobieństwo znalezienia dwóch osobników o tym samym genotypie we wszystkich dwudziestu loci jednocześnie wynosiło 5,33e-18. Na podstawie analizy genetycznej obejmującej kontrolę pochodzenia jenotów stwierdzono występowanie półrodzeństwa w jednym miocie w przeważającej liczbie miotów. W przypadku krycia samicy w trakcie jednej rui więcej niż jednym samcem, w 66,7% miotów były szczenięta pochodzące po różnych ojcach. Analiza sprzężeń wykazała istnienie dwóch grup sprzężeniowych, każdej złożonej z 9 locimikrosatelitarnych. Całkowita długość mapy wynosiła 419,5 cM, z odległościami między markerami wahającymi się od 9,0 do 39,3 cM. Średnia odległość pomiędzy loci wynosiła 26,2. Zaobserwowano zróżnicowane tempo rekombinacji pomiędzy płciami. Całkowita długość mapy samic wynosiła 493,6 cM, podczas gdy długość mapy samców – 410,8 cM. Markery jenota zostały przyporządkowane do grup sprzężeniowych podobnie jak u psa domowego. W grupie LGN1 jenota znalazły się markery, które tworzą grupę sprzężeniową w chromosomie CFA4 psa, natomiast loci mikrosatelitarne z LGN2 występowały w CFA15 psa. Kolejność ułożenia czterech markerów w grupie sprzężeniowej LGN1 i pięciu w LGN2 jenota była zgodna z występującą u psa. W przypadku pozostałych loci mikrosatelitarnych stwierdzono różnice w kolejności ich ułożenia pomiędzy gatunkami. Wartości współczynników odziedziczalności cech pokroju kształtowały się na stosunkowo wysokim poziomie (0,35–0,48). Oznacza to, że obserwowana w populacji zmienność cech użytkowych była w znacznym stopniu uwarunkowana addytywnym wpływem genotypu osobnika. Natomiast wartości uzyskanych oszacowań odziedziczalności cech reprodukcyjnych (0,12–0,20) wskazywały na niewielki udział zmienności genetycznej w zmienności fenotypowej. Na podstawie wyników mapowania QTL oraz wielkości wpływów addytywnych i dominacyjnych stwierdzono występowanie hipotetycznych regionów QTL o potwierdzonym statystycznie wpływie na masę ciała, jak też na czystość barwy okrywy włosowej jenotów. Najwyższe wartości statystyki testowej otrzymano dla czystości barwy okrywy włosowej i masy ciała w LGN2, odpowiednio: LR = 14,2 (p ≤ 0,05) i LR = 14,1 (p ≤ 0,05). Nieco niższą, również potwierdzoną statystycznie wartość testu wiarygodności odnotowano dla czystości barwy okrywy włosowej w LGN2. Średnie wpływy estymatorów addycji i dominacji potencjalnych QTL w większości przypadków okazały się negatywne. Prawdopodobną lokalizacją hipotetycznego QTL o najwyższej wartości statystyki testowej dla masy ciała jest odcinek, na którym na mapie psa i na mapie jenota występuje gen IGF-I. Skanowanie LGN1 również wskazało na prawdopodobne występowanie QTL determinujących masę ciała i czystość barwy okrywy włosowej jenotów, przy czym w jednym z przytoczonych obszarów w genomie psa oraz jenota znajduje się gen receptora hormonu wzrostu (GHR). Ze względu na występowanie par QTL związanych z cechami pokroju jenotów w poszczególnych grupach sprzężeniowych, oszacowano współdziałanie epistatyczne w obrębie poszczególnych par loci. Odnotowano epistatyczne współdziałanie pomiędzy loci związanymi z masą ciała jenotów zarówno w LGN1, jak i w LGN2. Wyniki wyraźnie wskazują na model z udziałem epistatycznych interakcji pomiędzy QTL w każdej z grup sprzężeniowych. 
Podsumowanie. Jedną z możliwości rozwoju wiedzy o genomie jenota jest wykorzystanie markerowych map genomowych opracowanych dla psa. Ortologia sekwencji DNA jenota i psa świadczy o konserwatyzmie genomowym obu gatunków psowatych. Analizy filogenetyczne z wykorzystaniem sekwencji mikrosatelitarnych wykazały odrębność genetyczną jenotów hodowlanych i dziko żyjących w Polsce. Opracowano wiarygodny system kontroli pochodzenia, który powinien być praktycznie stosowany w hodowli jenotów w Polsce, szczególnie w przypadku osobników typowanych do stada selekcyjnego. Kontrola pochodzenia potomstwa powinna być również niezbędnym elementem prowadzenia pracy hodowlanej i oceny BLUP. Potwierdzono występowanie półrodzeństwa ojcowskiego w jednym miocie jenotów i przedstawiono hipotezę o istnieniu mechanizmów pokopulacyjnej selekcji nasienia przez samice. Zaprzeczono możliwości określania biologicznych ojców wyłącznie na podstawie dokumentacji hodowlanej w przypadku promiskuityzmu. Przyporządkowanie markerów do grup sprzężeniowych przyczyniło się do rozwoju genetycznej mapy jenota. Analiza segregacji sekwencji mikrosatelitarnych wykazała daleko posunięty konserwatyzm układów sprzężeniowych w genomie jenota i psa. Wielkości wpływów addytywnych, dominacyjnych i epistatycznych zidentyfikowanych locicech ilościowych są potwierdzeniem poligenicznej determinacji analizowanych cech. Ustalone loci cech ilościowych jenota mogą być użyteczne w genetycznej poprawie cech pokroju, a w konsekwencji w selekcji wspomaganej markerami. Wytypowano geny IGF1 i GHR jako kandydujące dla cech produkcyjnych jenotów. Uzyskane wyniki badań molekularnych mogą mieć charakter aplikacyjny.