WERSJA POLSKA

ZESZYT 368

Grzegorz Borsuk
Zróżnicowanie morfometryczne, genetyczne, epigenetyczne i biochemiczne Varroa destructor opornych oraz wrażliwych na tau-fluwalinat 
zeszyt 368, ss. 80

Pierwotne zróżnicowanie genetyczne roztoczy z rodzaju Varroa pomogło im wykształcić zmienność adaptacyjną, a w konsekwencji przetrwać przez ponad 100 lat. Dostosowały się one do różnych gatunków pszczół, do różnych środowisk oraz wykształciły oporność na leki stosowane do ich zwalczania. W krótkim czasie są w stanie wytworzyć oporność krzyżową na akarycydy. Aby zapobiec wymieraniu rodzin pszczelich, poszukuje się przyczyn oporności roztoczy. Może ona być związana z przemianami enzymatycznymi w hemolimfie lub punktowymi mutacjami w kanale sodowym komórek mózgu. Zmienność w genach mitochondrialnych umożliwiła podzielenie roztoczy na haplogrupy i haplotypy. Przedmiotem tej rozprawy jest właśnie zmienność roztoczy Varroa destructor. Stwarza ona możliwości wykształcenia form opornych na leczenie i może być podstawą ich charakterystyki.

Celem pracy było zbadanie oporności V. destructor na tau-fluwalinat wpołudniowo-wschodniej Polsce oraz sprawdzenie, czy istnieje zróżnicowanie morfometryczne, zróżnicowanie w sekwencji mtDNA i zróżnicowanie biochemiczne pomiędzy samicami V. destructor opornymi i wrażliwymi na tau-fluwalinat, a także czy ich oporność może być związana z mechanizmami epigenetycznymi.Dodatkowym celem było określenie przynależności występujących w Polsce roztoczy V. destructor do opisanych na świecie haplogrup i sprawdzenie, czy taka przynależność nie ma powiązań z ich opornością na tau-fluwalinat.

Badania prowadzono w latach 2010–2012. Materiał do badań pobrano w 47 pasiekach południowo-wschodniej Polski. Łącznie pobrano 1439 roztoczy V. destructor. W celu odróżnienia roztoczy opornych od wrażliwych stosowano metodę Milaniego. Utworzono trzy grupy samic V. destructor: grupę kontrolną, grupę oporną i grupę wrażliwą. Przeprowadzono pomiary morfometryczne, analizy genetyczne, w tym RFLP-PCR, określono mutacje w czterech zsekwencjonowanych fragmentach mitochondrialnych genów (COI 320 pz, COI 929 pz, ATP6-CO III 818 pz, Cyt B 958 pz). Na podstawie sekwencji genów przeprowadzono analizę filogenetyczną samic V. destructor i określono procentowy udział całkowicie zmetylowanego genomu. Zbadano zmienność białek powierzchniowych oraz wykonano analizy biochemiczne.

Największy procentowy udział samic V. destructor opornych na tau-fluwalinat znaleziono w próbkach pobranych z pasiek w roku 2012 (34,17%), a najmniejszy w próbkach z 2011 roku (12,71%). Maksymalny procentowy udział samic V. destructor opornych na tau-fluwalinat w całej populacji wynosił 55%.

Największy procentowy udział samic V. destructor opornych na tau-fluwalinat stwierdzono w pasiekach, w których stosowano Bayvarol (36,92%) i Klartan (25,09%), a najmniejszy w pasiekach, gdzie stosowano Gabon (15,34%) i Apiwarol (13,93%). Dodatnią istotną korelację wykazano pomiędzy procentowym udziałem samic V. destructor opornych na tau-fluwalinat a ilością substancji czynnej podanej pszczołom w Bayvarolu (0,71), Klartanie (0,90) i Gabonie (0,94). Ujemną istotną korelację stwierdzono pomiędzy procentowym udziałem samic V. destructor opornych na tau-fluwalinat a ilością substancji czynnej podanej pszczołom z Apiwarolem (-0,74).

Tendencję do zwiększonej oporności wykazywały samice V. destructoro mniejszych rozmiarach ciała.

Samice V. destructor z grupy kontrolnej, grupy opornej i grupy wrażliwej na tau-fluwalinat miały identyczny wzór cięcia enzymami restrykcyjnymi, dlatego można przypuszczać, że należą do wspólnej haplogrupy. Po zsekwencjonowaniu czterech fragmentów genów okazało się, że samice V. destructor pochodzące z południowo-wschodniej Polski należą do wspólnej haplogrupy koreańskiej pierwszej (AmK1). Największą zmienność mutacyjną stwierdzono dla fragmentu genu Cyt B. Procentowy udział mutacji zmiany sensu w Cyt B był wyższy u samic V. destructor z grupy wrażliwej, a niższy u samic V. destructor z grupy opornej na tau-fluwalinat. Natomiast większy procentowy udział mutacji cichych obserwowano u samic V. destructor z grupy opornej, a niższy u samic z grupy wrażliwej na tau-fluwalinat.

Samice V. destructor z grupy opornej wykazywały najniższy procent całkowicie zametylowanego genomu w porównaniu z samicami V. destructor z grupy kontrolnej i wrażliwej na tau-fluwalinat.

Samice V. destructor z grupy opornej na tau-fluwalinat cechowało mniejsze stężenie białka na powierzchni ciała, ale białko to wykazywało większą aktywność proteolityczną. Oznacza to, że podanie akarycydów rodzinie pszczelej, które oddziałują na roztocza kontaktowo, może powodować koagulację białka na powierzchni ich ciała. Prowadzi to do powstania swego rodzaju „skorupy białkowej” i prawdopodobnie ograniczenia przenikalności akarycydów do wnętrza ciała roztoczy, co czyni je opornymi.

U samic V. destructor opornych na tau-fluwalinat stwierdzono najwyższe stężenie aminotransferazy alaninowej (ALAT), największy całkowity potencjał oksydacyjny (FRAP), a najniższe stężenie alkalicznej fosfatazy (ALP), Ɣ-glutamylotransferazy (GGT) i glukozy.

Na podstawie przeprowadzonych badań wykazano różnice w oporności samic V. destructor na tau-fluwalinat w zależności od cech morfometrycznych, genetycznego zróżnicowania w mtDNA, epigenetycznego zróżnicowania roztoczy, zróżnicowania białka powierzchniowego i podstawowych analiz biochemicznych. Stwierdzone różnice mogą być przyczyną powstawania oporności V. destructorna akarycydy stosowane do ich zwalczania.

Zwiększona oporność samic V. destructor na tau-fluwalinat może powodować znaczne straty rodzin pszczelich w pasiekach. Roztocza V. destructorwystępujące w południowo-wschodniej Polsce należą do haplogrupy koreańskiej pierwszej (AmK1). Zmutowane regiony w genie Cyt B mogą zmieniać konformację białek w błonie mitochondrium, przez co roztocza V. destructorstają się bardziej oporne. Oporność roztoczy może być regulowana mechanizmami epigenetycznymi. Tezy, które wysnuto z niniejszej pracy odnośnie mniejszych rozmiarów ciał roztoczy opornych, białek powierzchniowych roztoczy i podstawowych analiz biochemicznych wytyczają nowe kierunki badań nad mechanizmami oporności V. destructor.