Wpływ kwercetyny na poziom liczby komórek somatycznych w mleku krowim

Kwercetyna to naturalny związek roślinny występujący m.in. w cebuli, jabłkach i zielonej herbacie, znany ze swoich właściwości przeciwzapalnych. Może mieć znaczenie także w leczeniu zapaleń wymion u krów mlecznych – dowodzą tego badania przeprowadzone na Uniwersytecie Przyrodniczym w Lublinie. Naukowcy sprawdzili, jak kwercetyna podawana bezpośrednio do wymienia wpływa na liczbę komórek somatycznych w mleku i stan zdrowia krów, wskazując na jej potencjał jako naturalnego wsparcia w terapii mastitis.

Kwercetyna (łac. quercetum ‘las dębowy’) –  organiczny, wielopierścieniowy związek aromatyczny pochodzenia roślinnego, zaliczany do flawonoli.

Kwercetyna występuje m.in. w zielonej herbacie, czerwonej kapuście, cebuli, owocach jagód, pomidorach, winogronach,  wyce, zielu żurawki, zielu śledziennicy,  szparagach, szpinaku, papryce oraz nasionach czarnuszki siewnej. Znajduje zastosowanie w lecznictwie, posiada cenne właściwości przeciwzapalne i przeciwnowotworowe, wpływa również korzystnie na układ sercowo-naczyniowy oraz na metabolizm. 

Aktywność przeciwzapalną wykazuje poprzez hamowanie enzymów uczestniczących
w produkcji leukotrienów i prostaglandyn, hamuje również uwalnianie histaminy. Kwercetyna zmniejsza różnicowanie limfocytów Th1, zmniejszając poziom licznych cytokin i czynników, takich jak IL-1β, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-25, IL-33, MCP-1, NF-κB, VEGF-A, COX-2, 5-LOX, iNOS, NO, CRP, TNFα, TNFγ, IgE oraz zmniejszając ekspresję VCAM-1, ICAM-1, MIP-2. Aktualne badania wskazują, że kwercetyna zapobiega przewlekłym histopatologicznym zmianom grubości tkanki płucnej. Podjęto próbę wykorzystania kwercetyny w różnych chorobach u ludzi, na przykład w destrukcyjnej gruźlicy płuc, cukrzycy, reumatoidalnym zapaleniu stawów jak również w zespole suchego oka.

Farmakodynamiczny efekt kwercetyny po podaniu dowymieniowym u krów mlecznych ze stanem zapalnym gruczołu mlekowego wskazuje, że produkty bogate w naturalną kwercetynę mogą mieć potencjał terapeutyczny w zapaleniu wymion. Wiele badań wskazuje, że IL-6 może być markerem  zapalenia gruczołu mlekowego. TNFα, NF-κB, IL-1β i IL-8 uwalniane z komórek nabłonka gruczołu mlekowego bydła odgrywają ważną rolę w stanach zapalanych gruczołu mlekowego. Na podstawie tych ustaleń i mechanizmu działania kwercetyny przeprowadzona została analiza pilotażowa tolerancji kwercetyny i jej wpływu na liczbę komórek somatycznych (SCC) po wielokrotnym dowymieniowym  podaniu  u  krów  mlecznych z klinicznym zapaleniem gruczołu mlekowego.

Stosowanie dowymieniowe kwercetyny u bydła mlecznego.

 Roztwór kwercetyny w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem – PBS przygotowano, w łaźni ultradźwiękowej, wytrząsano przez 30 min w temp. 37 °C. (30 mg kwercetyny w 5 ml PBS). Wpływ immunomodulacyjny po podaniu dowymieniowym trudno ograniczyć do efektu zlokalizowanego tylko w jednej ćwiartce zapalnej, dlatego lek podano do wszystkich ćwiartek. Krowy biorące udział w badaniu dostawały kwercetynę do wszystkich ćwiartek, więc całkowita dawka na wymię wynosiła 120 mg kwercetyny/wymię/dzień. Taką dawkę kontynuowano między podaniem pierwszego i trzeciego dnia (D1–D3). Po monitorowaniu wyjściowym (B1–B3) i trzech dniach aplikacji (D1–D3), dawkę dzienną skorygowano do niższej – 10 mg/ćwiartkę/dzień (D4–D8) i w konsekwencji przeprowadzono ostatnią fazę badania z całkowitą dawką 40 mg kwercetyny/wymię/dzień.

  Ryc. 2. (zdj. Artur Burmańczuk)

 . 

Badanie przeprowadzono na krowach ≈ 600 kg m.c., rasy HO (holsztyńsko-fryzyjska), w wieku od 4 do 7 lat. Do badania włączono tylko krowy z jedną ćwiartką wykazującą stan zapalny. Przed podaniem leku każde wymię zostało zdezynfekowane. Próbki mleka do analiz (0,5 l) pobierano raz dziennie z zapalonej ćwiartki, bezpośrednio przed codziennym porannym dojem.

Próbki mleka pobierano na początku badania (B1–B3), (D1–D3), (D3–D8) i po ostatniej dawce (R1–R3). Pobieranie próbek krwi do analizy odpowiedzi immunologicznej (6 próbek od każdej krowy) wykonywano raz dziennie przed porannym dojem na początku badania (B1–B3) i po ostatniej dawce (R1–R3).

Ryc. 3. Dzienne zmiany liczby komórek somatycznych (SCC) w mleku krów po dowymieniowym podaniu kwercetyny

Analizę bazową (hematologia, TNFα, SCC) przeprowadzano co 24 godziny u wszystkich krów na trzy dni przed pierwszą dawką (B1–B3). Próbki krwi analizowano pod kątem wybranych parametrów krwi, takich jak: WBC – objętość białych krwinek; RBC – objętość czerwonych krwinek; Hb – hemoglobina; Hct – hematokryt; MCV – średnia objętość krwinki; MCH – średnia hemoglobina krwinki; MCHC – średnie stężenie hemoglobiny krwinki; RDW – szerokość rozkładu czerwonych krwinek; Plt – płytki krwi; Fib – fibrynogen.. Analizę SCC przeprowadzono przy użyciu analizatora Bentley BactoCount IBCm (Bentley Instruments Inc.) bezpośrednio po pobraniu próbek mleka. Odpowiedź immunologiczną mierzono przy użyciu poziomu TNFα w surowicy krwi, stosując metodę ELISA.

Począwszy od D1 i kontynuując do D8, spadek SCC w stosunku do wartości wyjściowej charakteryzował się tendencją spadkową (p < 0,0001). Po 3 dniach podawania kwercetyny w dawce 120 mg/wymię (D1–D3), SCC zmniejszyło się o 14,12% w odniesieniu do średniej arytmetycznej wartości wyjściowej. Jednakże spadek ten nie był statystycznie istotny, ponieważ p > 0,05. Nachylenie mediany (wartość środkowa) dla SCC w fazie D1-D3 wskazywało, że t1/2 SCC w odniesieniu do wartości wyjściowej przy zachowaniu stosowanej dawki wynosi ≈85,45 h. Na podstawie średniej arytmetycznej wskazywało, że t1/2SCC w odniesieniu do wartości wyjściowej przy zachowaniu stosowanej dawki może osiągnąć ≈333,07 h (≈2 tygodnie leczenia). Po kolejnych 5 dniach podawania kwercetyny w mniejszej dawce 40 mg/wymię (D4–D8) zaobserwowano znaczny spadek SCC o 114,65% przy odniesieniu do średniej arytmetycznej wartości wyjściowej p < 0,05. Z drugiej strony, nachylenie mediany SCC w fazie D4–D8 wskazywało, że t1/2SCC przy odniesieniu do wartości wyjściowej przy zachowaniu stosowanej dawki osiąga ≈135,44 h. W okresie D4–D8 odnotowano wahania mediany, przy czym szczyt ustalono na okres D6. Nachylenie wartości środkowej SCC w fazie D6–D8 wskazywało, że t1/2SCC w odniesieniu do wartości bazowej przy zachowaniu stosowanej dawki może osiągnąć ≈38,98 h. W trakcie badania odnotowano dużą zmienność międzyosobniczą SCC wyrażoną jako RSD%. W okresie rekonwalescencji [R1–R3] monitorowano tylko produkcję mleka, a w analizie organoleptycznej nie zaobserwowano żadnych zmian przez kolejne dni po ostatniej dawce kwercetyny.

Kilka kluczowych parametrów hematologicznych uległo istotnym zmianom w trakcie doświadczenia (MCHC – średnie stężenie hemoglobiny w erytrocytach , RDW – objętość czerwonych krwinek oraz fibrynogen), jednak wartości te mieściły się w granicach określonych jako fizjologiczne dla bydła mlecznego. Badania wykazały, że wpływ na poziom TNFα we krwi obwodowej po podaniu dowymieniowym kwercetyny nie jest istotny. W fazie B1–B3 średnie stężenie TNFα wynosiło 104,2 ± 43,32 pg/ml. W fazie R1–R2 poziom TNFα we krwi obwodowej nie zmieniał się istotnie i wynosił 112,90 ± 64,44 pg/ml. Synteza TNFα jest przede wszystkim indukowana przez toksyny bakteryjne. W przedstawionych badaniach kwercetynę podawano zwierzętom z podwyższoną wartością SCC (powyżej 400tys/ml) wskazującą na zapalenie gruczołu mlekowego.

Ryc. 4. (zdj. Artur Burmańczuk)

 . 

Poszukiwanie skutecznej dawki w przypadku leków immunomodulujących jest trudne, zwykle ze względu na nieliniową odpowiedź układu odpornościowego. Potencjalne zastosowanie kemferolu, który jest flawonoidem i bliskim homologiem kwercetyny, odnotowano w mysim modelu zapalenia wymion. Jednak wpływ kwercetyny na SCC w zwierzęcym modelu krów mlecznych nie został dotychczas zbadany. Przedstawione badanie ilustruje badania pilotażowe. W przypadku immunomodulatorów efekt farmakodynamiczny jest zwykle zależny od wielu nakładających się mechanizmów. Często zależy nie tylko od dawki lub odstępu między dawkami, ale również od sekwencji przerw podczas podawania.

Jednym z kluczowych markerów stanu zapalnego, wytwarzanym lokalnie, jest TNFα Stwierdzono, że kwercetyna znacząco obniża ekspresję tego genu. Najnowsze badania wskazują, że kwercetyna indukuje ekspresję inhibitora proteazy leukocytów, co z kolei zmniejsza wydzielanie TNFα, które ma kluczowe znaczenie dla podstawowych mechanizmów regulacyjnych w obrębie układu odpornościowego. Dlatego można stwierdzić, że po dowymieniowym podaniu kwercetyny w wyżej wymienionych dawkach nie należy oczekiwać ogólnego wpływu na układ odpornościowy.

Dodatkowo w tym przypadku można również stwierdzić, że po podaniu dowymieniowym kwercetyny nie ma istotnego wpływu na obraz krwi w ciągu 8 dni podawania. Badania in vitro potwierdziły działanie farmakologiczne kwercetyny w bardzo szerokim zakresie stężeń 10–200 μM. Wiadomo również, że niektóre z nich mają zależny od dawki przebieg. Podanie kwercetyny w dawce 120 mg/wymię, co 24 godziny przez 3 kolejne dni i 40 mg/wymię co 24 godziny przez kolejne pięć dni nie powoduje istotnych zmian w obrazie krwi. Obecność istotnych wahań i powrót do trendu spadkowego SCC wyrażonego medianą jest w tym przypadku obrazem złożonych interakcji między kwercetyną a układem odpornościowym.

Artur Burmańczuk, Beata Łebkowska-Wieruszewska
Katedra Farmakologii, Toksykologii i Ochrony Środowiska,
Wydział Medycyny Weterynaryjnej,
Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie